Кинетика ферментативных реакций рассматривается в работах Ментен и Михаэлиса. Подробно ученые описали данный вопрос в уравнении фермент-субстратного комплекса.
Определение
Особенности кинетики ферментативных реакций рассматриваются в науке о ферментах, которая изучает зависимость скорости такого процесса от химических особенностей субстрата, среды, инородных факторов, воздействующих на ход химической реакции.
При существенной концентрации субстрата, она не будет оказывать влияния на скорость процесса.
Специфика протекания
Анализ активности ферментов осуществляется при значительных концентрациях субстратов (нулевом порядке химического процесса). В подобных условиях на изменение скорости процесса будет влиять лишь количество фермента.
Кинетика ферментативных реакций в живых клетках имеет некоторые отличительные характеристики. Ферменты в них применяют не во всю силу. При избыточном количестве субстрата, что возможно в условиях эксперимента, скорость реакции будет пропорциональная количеству фермента. При существенном увеличении этого показателя, наблюдается нарушение подобной пропорциональности.
Действие модуляторов на ферменты
Кинетика ферментативных реакций объясняет линейное возрастание скорости процесса с повышением содержания субстрата. При чрезмерном росте его концентрации наблюдается уменьшение субстрата, снижается быстрота протекания химического процесса.
Кинетика ферментативных реакций подтверждает зависимость активности ферментов от рН среды, специфики фермента, его количества. Вещества, которые влияют на ход подобной реакции, именуют модуляторами либо эффекторами. Их принято подразделять на ингибиторы и активаторы, способствующие замедлению либо ускорению определенного процесса.
Основы кинетики ферментативных реакций дают возможность в полной мере понимать суть воздействия этих веществ. Часть из них считается натуральными регуляторами процесса метаболизма. Есть разные типы модуляторов активности ферментов, которые отличаются друг от друга по механизму воздействия и строению.
Варианты активаторов
Чем характеризуется кинетика ферментативных реакций? Биохимия рассматривает в качестве активаторов желчные кислоты, ионы металлов, анионы. Бывают такие ситуации, когда одно вещество в отношении одного фермента будет выступать активатором, а в ином случае является ингибитором. Специфическими активаторами для выявления ферментов выступают ионы металлов.
Они могут стимулировать процесс присоединения к ферменту субстрата, участвуют в образовании его третичной структуры либо могут выступать в качестве части активного центра.
Какова кинетика ферментативных реакций? Кратко можно отметить, что катионы многих металлов - это обязательные компоненты, необходимые для полноценной работы многих ферментов. Для некоторых из них требуется сразу несколько разных ионов. К примеру, для АТФазы, которая производит транспорт ионов через плазматическую мембрану, требуются ионы магния, натрия, калия.
Металлы могут находиться в составе простетической группы ферментов. К примеру, железо считается важным компонентом каталазы в составе порфириновых соединений. Кобальт есть в составе простетической группы метилмалонилизомеразы и гомоцистеинтрансметилазы, а марганец необходим для активации изоцитратдегидрогеназы. Есть группа ферментов, которая активируется с помощью цАМФ. Подобные ферменты именуются протеинкиназы. Она состоит из двух субъединиц:
- каталитической, которая содержит активный центр;
- регуляторная, где располагается центр связывания цАМФ.
Только при взаимодействии регуляторного центра фермента и ц-АМФ, он приобретает активность.
Кинетика ферментативных реакций: константа Михаэлиса, условия протекания, все это подробно рассматривается в физической химии.
Особенности ферментов
Они являются компактными молекулами, имеют относительную молекулярную массу от 104, диаметр от 20А. Ферменты, которые входят в состав глобулярных белков, образуются при определенном соединении пептидными связями 20 аминокислотных остатков.
Внутреннее строение ферментов в биохимии характеризуется четырьмя типами структур:
- первичная связана с генетическим кодом;
- вторичная структура характеризует спирализацию цепи;
- третичная определяет пространственное укладывание спирали полипептидной цепи;
- четверичная связана с объединением глобул в активный олигомерный фермент.
Специфика процессов с одним субстратом
Кинетика ферментативных реакций уравнения Михаэлиса - Ментен объясняет связь между скоростью и концентрациями субстрата.
В 1903 году Л. Анри допустил, что фермент с субстратом образует некое промежуточное соединение. Если сам фермент считать Е, субстрат S, в таком случае интермедиат будет иметь вид ES.
Л. Михаэлис взял для анализа кинетики данного процесса механизм, который включает в себя две стадии: обратимую, необратимую.
Кинетические уравнения двух этих процессов имеют достаточно сложный вид. Для их решения используют стационарные концентрации. Скорость получения промежуточного соединения описывается законом действующих масс, связывает между собой начальные концентрации субстрата и фермента, текущие показатели, а также концентрации промежуточного вещества и продукта взаимодействия.
Особенности решения
Каковы основные кинетики ферментативных реакций? Таблица, используемая в физической химии, позволяет решать систему уравнений в следующих случаях:
- при уменьшении концентрации исходных веществ;
- при превышении количества продукта в сравнении с промежуточным комплексом.
Для ферментативных процессов выполняется соотношение скоростей, при котором вторая константа существенно превышает величину первой. Причина в неустойчивости промежуточного соединения, его несущественной концентрации.
По решению ИЮПАК константа, позволяющая описывать кинетику химического процесса, была названа константой Михаэлиса.
Экспериментальным путем была подтверждена линейная зависимость начальной скорости от концентрации субстрата.
Физический смысл константы Михаэлиса
Для того чтобы ответить на этот вопрос, принимают концентрацию субстрата, при которой фермент проявляет половину своей активности. Константа Михаэлиса имеет такую же размерность, что и первоначальная концентрация субстрата: моль\л.
Численные параметры данной постоянной величины располагаются в пределах 10 -2-10-8 М. В ходе экспериментальных исследований было установлено, что константа Михаэлиса является функцией температуры. Она зависит от наличия иных веществ, которые выполняют в процессе роль активатора либо ингибитора.
Частный случай
Если в ходе процесса достигается состояние, при котором наблюдается равенство констант, в системе устанавливается равновесие. Это дает возможность применять в ходе анализа ферментативных процессов приближение квазиравновесных концентраций.
В итоге существенно упрощается выражение для константы Михаэлиса, она характеризует сродство фермента к используемому субстрату.
Ингибирование ферментативных процессов
В качестве таких веществ выступают реактивы, которые при введении их в реакционную систему, существенно уменьшают скорость взаимодействия. Для ферментативного катализа требуется предварительна адсорбция субстрата, его четкое ориентирование относительно активных групп каталитического центра, а для ингибирования можно ограничиться только обычного связывания ингибитора с некоторыми фрагментами адсорбционного участка.
Проявлять свойства ингибиторов соединения могут из-за образования прочных комплексов (цианиды), а также при действии на карбонильную группу с денатурацией белков.
Типы ингибирования
Эффект замедления химического взаимодействия наблюдается по нескольким причинам:
- Ингибитор конкурирует за активный центр с субстратом, создавая с ферментом неактивный центр. В случае роста концентрации субстрата, восстанавливается активность в растворе самого фермента.
- Ингибитор присоединяется к иной части молекулы белка, формируя при этом неактивный комплекс. Фермент восстанавливает свою первоначальную активность под воздействием иных веществ, не затрагивая субстрата.
Скорость процесса связана со скоростью формирования конечного продукта через концентрации, константу Михаэлиса. Последнюю величину можно определять графически, а также выражать математическим путем из формулы. При неактивном комплексе ингибитор не мешает реакции между ферментом и субстратом, но существенно снижает скорость процесса.
При статистической обработке экспериментальных данных удалось для неконкурентного ингибирования выявить основные параметры, доказать связь между величиной скорости и показателями концентраций.
Кинетика химических процессов предполагает описание особенностей всех стадий используя постоянные величины, уравнение Михаэлиса-Ментен. В ходе экспериментальных исследований была выявлена зависимость между скоростью ферментативного процесса и изменением концентрации продукта взаимодействия или исходного субстрата.
Кроме того, установлена связь скорости с природой фермента. Именно от его особенностей напрямую зависит активность, особенности поведения в ходе взаимодействия. Мерой активности фермента считается одна стандартная единиц, характеризующая количество фермента, катализирующее превращение к мкмоль исходного субстрата за минуту.
Ферменты широко применяются в современной медицине, от их активности напрямую зависит быстрота определения проблемы, а также качество постановки медицинского диагноза пациенту.
Общие принципы кинетики химических реакций применимы и к ферментативным реакциям. На основании большого числа экспериментальных исследований было установлено, что зависимость скорости ферментативного процесса от концентрации субстрата в общем виде можно представить кривой, изображенной на рис. 5.5.
Рис. 5.5. Общий вид зависимости стационарной скорости протекания ферментативной реакции (v CT) от концентрации субстрата ([S]) при постоянной концентрации фермента:
а - реакция первого порядка (при [S] Км скорость реакции пропорциональна концентрации субстрата); б - реакция смешанного порядка; в - реакция нулевого порядка, когда v ct ~ v max и скорость реакции не зависит от концентрации субстрата
При низкой концентрации субстрата зависимость стационарной скорости реакции от концентрации субстрата (см. рис. 5.5, участок а) близка к линейной и подчиняется кинетике реакций первого порядка, т. е. скорость реакции S -* Р прямо пропорциональна концентрации субстрата S и в любой момент времени t определяется следующим кинетическим уравнением: где [S] - молярная концентрация субстрата S; - d[S]/d/ - скорость убыли субстрата; к константа скорости реакции, которая в данном случае имеет размерность, обратную единице времени. При высокой концентрации субстрата (участок в) скорость реакции максимальна, постоянна и не зависит от концентрации субстрата [S]. В этих условиях реакция подчиняется кинетике реакций нулевого порядка v = к" и целиком определяется концентрацией фермента.
В данном случае проявляется важная особенность ферментативных реакций - явление насыщения фермента субстратом. На участке б скорость реакции пропорциональна произведению концентраций двух реагирующих веществ (субстрата и фермента), т. е. реакция протекает по законам реакции второго порядка. Из приведенной на рис. 5.5 зависимости видно, что изменение концентрации субстрата в области низких значений существенно влияет на скорость процесса, а при высоких концентрациях субстрата это влияние очень мало или практически отсутствует. При низких концентрациях субстрата скорость реакции контролируется двумя факторами: собственно скоростью катализируемой ферментом реакции и частотой столкновения фермента с субстратом. По мере увеличения концентрации субстрата частота столкновений перестает быть фактором, определяющим скорость реакции.
Уравнения кинетики последовательных реакций (5.5), (5.8), (5.9) справедливы и для кинетики ферментативных реакций, тщательное изучение которых показало, что общий вид кинетических кривых расходования субстрата S имеет 5-образный вид, типичный для реакций последовательного превращения (рис. 5.6).
Рис. 5.6.
I - начальный участок (период индукции), который длится менее долей секунды и занимает незначительную часть общего времени протекания реакции. Здесь скорость меняется от нулевой до v CT ; II - стационарный участок. На этом участке скорость остается примерно постоянной в течение нескольких минут; III - основной участок, на который приходится большая часть времени протекания реакции; здесь скорость монотонно падает
Такой вид кривой расходования субстрата по модели, предложенной Михаэлисом и Ментен, объясняется образованием промежуточного комплекса в ферментативном процессе: в ходе ферментативной реакции субстрат S образует с молекулой фермента Е соединение - фермент-субстратный комплекс ES, распадающийся по двум направлениям. При распаде по первому пути вновь образуется исходная молекула субстрата S и фермента Е. При распаде по другому пути образуется молекула продукта Р и регенерируется молекула фермента. Таким образом, механизм ферментативного процесса (ферментативного катализа) описывается как последовательная реакция фермент + субстрат фермент-субстратный комплекс -» продукт + фермент, в которой фермент Е связывается с субстратом S в обратимой реакции (константы скоростей к, к 2) с образованием фермент-субстратного комплекса ES. Последний распадается в реакции с константой скорости Аз на фермент Е и продукт Р:
Экспериментальные доказательства рассмотренного механизма действия ферментов впервые получили Л. Михаэлис и М. Ментен (1913), принявшие, что промежуточный фермент-субстратный комплекс ES обратимо образуется согласно закону действия масс:
Они полагали, что скорость распада ES с образованием продукта Р мала по сравнению со скоростью установления равновесия, определяемого к и к 2 . На основании данных предположений было выведено уравнение, названное в честь авторов уравнением Михаэлиса-Ментен, выражающее количественное соотношение между концентрацией субстрата и стационарной скоростью ферментативной реакции:
где v max - максимальная скорость реакции при больших концентрациях субстрата (см. рис. 5.6), а К м
- константа Михаэлиса,
представляющая собой константу диссоциации фермент-субстратного комплекса на фермент и исходный субстрат.
. В
модели предполагается, что продукт не может обратно превращаться в субстрат (что справедливо для ранних стадий реакции, когда концентрация продукта низкая). Поскольку на начальной стадии реакции концентрация Р мала, то и вероятность обратной реакции продукта с ферментом бесконечно мала, и тогда к }
определяет скорость всего процесса. В этом случае скорость ферментативной реакции v CT определяется как
,
что и подтверждает наличие прямолинейного начального участка на рис. 5.6.
В дальнейшем данная модель была развита с учетом того, что концентрация фермент-субстратного комплекса ES может уменьшаться с заметной скоростью.
В уравнении Михаэлиса-Ментен (5.12) величины v max , К м постоянны для данного фермента, хотя могут меняться независимо друг от друга при различных условиях.
Если [S]« К м, то
и реакция подчиняется уравнению первого порядка.
При [S] » К м
Это означает, что реакция не зависит от концентрации субстрата и протекает по уравнению нулевого порядка.
При К м = [S] , г ст = Vmax/2, т. е. К м численно равна концентрации субстрата [S], при которой скорость реакции составляет половину максимальной величины. Это равенство может использоваться для определения константы Михаэлиса-Ментен.
Уравнение Михаэлиса-Ментен (5.12) можно преобразовать аналогично преобразованиям Гендерсона-Гассельбаха для диссоциации слабых электролитов:
или
Рис. 5.7.
На рис. 5.7 показана кинетическая кривая ферментативной реакции, построенная по уравнению Михаэлиса-Ментен, представляющая собой гиперболическую зависимость стационарных скоростей катализируемой ферментом реакции от концентрации субстрата.
Для графического определения К м уравнение (5.12) может быть преобразовано следующим образом:
из которого следует линейная зависимость 1/v от 1/[S].
Подобное преобразование первыми предложили Г. Лайнуивер и Д. Бэрк, поэтому уравнение (5.13) и график (рис. 5.8) носят их имена. Тангенс угла наклона прямой на рис. 5.8 равен соотношению
Рис. 5.8.
К м /v max , величина, отсекаемая на оси 1/v, соответствует значению
Если на графике (см. рис. 5.8) провести линию до пересечения с осью 1/[S], то в точке 1/v = О 1/[S] - -1/*м-
Таким образом, при экспериментальном определении скорости процесса минимум при двух различных концентрациях субстрата можно получить константу К м.
Свойства ферментов
1. Зависимость скорости реакции от температуры
Зависимость активности ферментов (скорости реакции) от температуры описывается колоколообразной кривой с максимумом скорости при значениях оптимальной температуры для данного фермента . Повышение скорости реакции при приближении к оптимальной температуре объясняется увеличением кинетической энергии реагирующих молекул.
Зависимость скорости реакции от температуры
Закон о повышении скорости реакции в 2-4 раза при повышении температуры на 10°С справедлив и для ферментативных реакций, но только в пределах до 55-60°С, т.е. до температур денатурации белков. При понижении температуры активность ферментов понижается, но не исчезает совсем.
Как исключение, имеются ферменты некоторых микроорганизмов, существующих в воде горячих источников и гейзеров, у них оптимум температуры приближается к точке кипения воды. Примером слабой активности при низкой температуре может служить зимняя спячка некоторых животных (суслики, ежи), температура тела которых понижается до 3-5°С. Это свойство ферментов также используется в хирургической практике при проведении операций на грудной полости, когда больного подвергают охлаждению до 22°С.
Ферменты могут быть очень чувствительны к изменению температуры:
- у сиамских кошек мордочка, кончики ушей, хвоста, лапок черного цвета. В этих областях температура всего на 0,5°С ниже, чем в центральных областях тела. Но это позволяет работать ферменту, образующему пигмент в волосяных луковицах, при малейшем повышении температуры фермент инактивируется,
- обратный случай - при понижении температуры окружающего воздуха у зайца-беляка пигментообразующий фермент инактивируется и заяц получает белую шубку,
- противовирусный белок интерферон начинает синтезироваться в клетках только при достижении температуры тела 38°С,
Бывают и уникальные ситуации:
- для большинства людей повышение температуры тела на 5°С (до 42°С) несовместимо с жизнью из-за дисбаланса скорости ферментативных реакций. В то же время у некоторых спортсменов обнаружено, что при марафонском беге их температура тела составила около 40°С, максимальная зарегистрированная температура тела была 44°С.
2. Зависимость скорости реакции от рН
Зависимость также описывается колоколообразной кривой с максимумом скорости при оптимальном для данного фермента значении рН.
Данная особенность ферментов имеет существенное значение для организма в его адаптации к изменяющимся внешним и внутренним условиям. Сдвиги величины рН вне- и внутри клетки играет роль в патогенезе заболеваний, изменяя активность ферментов разных метаболических путей.
Для каждого фермента существует определенный узкий интервал рН среды, который является оптимальным для проявления его высшей активности. Например, оптимальные значения рН для пепсина 1,5-2,5, трипсина 8,0-8,5, амилазы слюны 7,2, аргиназы 9,7, кислой фосфатазы 4,5-5,0, сукцинатдегидрогеназы 9,0.
Зависимость скорости реакции от величины pH
Зависимость активности от кислотности среды объясняется наличием аминокислот в структуре фермента, заряд которых изменяется при сдвиге рН (глутамат, аспартат, лизин, аргинин, гистидин). Изменение заряда радикалов этих аминокислот приводит к изменению их ионного взаимодействия при формировании третичной структуры белка, изменению его заряда и появлению другой конфигурации активного центра и, следовательно, субстрат связывается или не связывается с активным центром.
Изменение активности ферментов при сдвиге рН может нести и адаптивные функции. Так, например, в печени ферменты глюконеогенеза требуют меньшей рН, чем ферменты гликолиза , что удачно сочетается с закислением жидкостей организма при голодании или физической нагрузке.
Для большинства людей сдвиги величины рН крови за пределы 6,8-7,8 (при норме 7,35-7,45) несовместимы с жизнью из-за дисбаланса скорости ферментативных реакций. В то же время у некоторых марафонцев обнаружено снижение рН крови в конце дистанции до 6,8-7,0. И ведь при этом они сохраняли работоспособность!
3. Зависимость от количества фермента
При увеличении количества молекул фермента скорость реакции возрастает непрерывно и прямо пропорционально количеству фермента, т.к. большее количество молекул фермента производит большее число молекул продукта.
Ферментативная кинетика исследует влияние химической природы реагирующих веществ (ферментов, субстратов) и условий их взаимодействия (рН среды, температура, концентрация, присутствие активаторов или ингибиторов) на скорость ферментативной реакции. Скорость ферментативной реакции (u) измеряют по убыли количества субстрата или приросту продукта реакции за единицу времени.
При низкой концентрации субстрата скорость реакции
прямо пропорциональна его концентрации. При высокой концентрации субстрата, когда все активные центры фермента заняты субстратом (насыщение фермента субстратом ), скорость реакции максимальна, становится постоянной и не зависящей от концентрации субстрата [S] и полностью зависит от концентрации фермента (рис. 19).
K S – константа диссоциации фермент-субстратного комплекса ES, обратна константе равновесия:
.
Чем меньше значение K S , тем выше сродство фермента к субстрату.
 |
| Рис. 19. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата при постоянной концентрации фермента |
Количественное соотношение между концентрацией субстрата и скоростью ферментативной реакции выражает уравнение Михаэлиса-Ментен :
,
u - скорость реакции, u max - максимальная скорость ферментативной реакции.
Бриггс и Холдейн усовершенствовали уравнение, введя в него константу Михаэлиса K m , определяемую экспериментально.
Уравнение Бриггса – Холдейна:
,
.
Константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата (моль/л), при которой скорость ферментативной реакции составляет половину от максимальной (рис. 20). К m показывает сродство фермента к субстрату: чем меньше ее значение, тем больше сродство.
Экспериментальные значения К m для большинства ферментативных реакций с участием одного субстрата обычно 10 -2 -10 -5 М. Если реакция обратима, то взаимодействие фермента с субстратом прямой реакции характеризуется К m , отличающейся от таковой для субстрата обратной реакции.
Г. Лайнуивер и Д. Берк преобразовали уравнение Бриггса – Холдейна и получили уравнение прямой линии: у = ах + b (рис. 21):
.
Метод Лайнуивера – Берка дает более точный результат.
Рис. 21. Графическое определение константы Михаэлиса
по методу Лайнуивера-Берка
СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ
Ферменты отличаются от обычных катализаторов рядом свойств.
Термолабильность , или чувствительность к повышению температуры (рис. 22).
Рис. 22. Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры
При температуре, не превышающей 45–50 °С, скорость большинства биохимических реакций повышается в 2 раза при повышении температуры на 10 °С согласно правилу Вант-Гоффа. При температуре выше 50 °С на скорость реакции влияниет тепловая денатурация белка-фермента, постепенно приводящая к его полной дезактивации.
Температура, при которой каталитическая активность фермента максимальна, называется его температурным оптимумом. Температурный оптимум для большинства ферментов млекопитающих находится в пределах 37-40 °С. При низких температурах (0 °С и ниже) ферменты, как правило, не разрушаются, хотя активность их снижается практически до нуля.
Зависимость активности фермента от значения рН среды (рис. 23).
Для каждого фермента существует оптимальное значение рН среды, при котором он проявляет максимальную активность. рН-оптимум действия ферментов животных тканей лежит в пределах узкой зоны концентрации водородных ионов, соответствующей выработанным в процессе эволюции физиологическим значениям рН среды 6,0-8,0. Исключения составляют пепсин – 1,5-2,5; аргиназа – 9,5-10.
 |
| Рис. 23. Зависимость скорости ферментативной реакции от рН среды |
Влияние изменений рН среды на молекулу фермента заключается в воздействии на степень ионизации его активных групп, а, следовательно, на третичную структуру белка и состояние активного центра. рН меняет также ионизацию кофакторов, субстратов, фермент-субстратных комплексов и продуктов реакции.
Специфичность. Высокая специфичность действия ферментов обусловлена конформационной и электростатической комплементарностью между молекулами субстрата и фермента и уникальной структурной организацией активного центра, обеспечивающими избирательность протекания реакции.
Абсолютная специфичность – способностьфермента катализировать единственную реакцию. Например, уреаза катализирует реакцию гидролиза мочевины до NH 3 и СО 2 , аргиназа – гидролиз аргинина.
Относительная (групповая) специфичность – способность фермента катализировать группу реакций определенного типа. Относительной специфичностью, например, обладают гидролитические ферменты пептидазы, гидролизующие пептидные связи в молекулах белков и пептидов, липаза, гидролизующая сложноэфирные связи в молекулах жиров.
Стереохимической специфичностью обладают ферменты, катализирующие превращения только одного из пространственных изомеров. Фермент фумараза катализирует превращение транс-изомера бутендиовой кислоты - фумаровой кислоты в яблочную, и не действует на цис-изомер - малеиновую кислоту.
Высокая специфичность действия ферментов обеспечивает протекание лишь определенных химических реакций из всех возможных превращений.
§ 12. КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ
Кинетика ферментативных реакций – наука о скоростях ферментативных реакций, их зависимости от различных факторов. Скорость ферментативной реакции определяется химическим количеством прореагировавшего субстрата или образовавшегося продукта реакции в единицу времени в единице объема при определенных условиях:
где v – скорость ферментативной реакции, – изменение концентрации субстрата или продукта реакции, t – время.
Скорость ферментативной реакции зависит от природы фермента, которая определяет его активность. Чем выше активность фермента, тем выше скорость реакции. Активность фермента определяют по скорости реакции, катализируемой ферментом. Мерой активности фермента является одна стандартная единица активности фермента. Одна стандартная единица активности фермента – это такое количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата за 1 минуту.
В процессе ферментативной реакции фермент (Е) взаимодействует с субстратом (S), в результате образуется фермент-субстратный комплекс, который затем распадается с высвобождением фермента и продукта (Р) реакции:
Скорость ферментативной реакции зависит от многих факторов: от концентрации субстрата и фермента, температуры, рН среды, наличия различных регуляторных веществ, способных увеличивать или снижать активность ферментов.
Интересно знать! Ферменты используются в медицине для диагностики различных заболеваний. При инфаркте миокарда вследствие повреждения и распада сердечной мышцы в крови резко возрастает содержание ферментов аспартаттрансаминазы и аланинаминотрансферазы. Выявление их активности позволяет диагностировать данное заболевание.
Влияние концентрации субстрата и фермента на скорость ферментативной реакции
Рассмотрим влияние концентрации субстрата на скорость ферментативной реакции (рис. 30.). При низких концентрациях субстрата скорость прямо пропорциональна его концентрации, далее с ростом концентрации скорость реакции увеличивается медленнее, а при очень высоких концентрациях субстрата скорость практически не зависит от его концентрации и достигает своего максимального значения (V max). При таких концентрациях субстрата все молекулы фермента находятся в составе фермент-субстратного комплекса, и достигается полное насыщение активных центров фермента, именно поэтому скорость реакции в этом случае практически не зависит от концентрации субстрата.
Рис. 30. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата
График зависимости активности фермента от концентрации субстрата описывается уравнением Михаэлиса – Ментен, которое получило свое название в честь выдающихся ученых Л.Михаэлиса и М.Ментен, внесших большой вклад в исследование кинетики ферментативных реакций,
где v – скорость ферментативной реакции; [S] – концентрация субстрата; K M – константа Михаэлиса.
Рассмотрим физический смысл константы Михаэлиса. При условии, что v = ½ V max , получаем K M = [S]. Таким образом, константа Михаэлиса равна концентрации субстрата, при которой скорость реакции равна половине максимальной.
Скорость ферментативной реакции зависит и от концентрации фермента (рис. 31). Эта зависимость носит прямолинейный характер.
Рис. 31. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации фермента
Влияние температуры на скорость ферментативной реакции
Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры представлена на рис. 32.
Рис. 32. Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры.
При низких температурах (приблизительно до 40 – 50 о С) повышение температуры на каждые 10 о С в соответствии с правилом Вант-Гоффа сопровождается увеличением скорости химической реакции в 2 – 4 раза. При высоких температурах более 55 – 60 о С активность фермента резко снижается из-за его тепловой денатурации, и, как следствие этого, наблюдается резкое снижение скорости ферментативной реакции. Максимальная активность ферментов наблюдается обычно в пределах 40 – 60 о С. Температура, при которой активность фермента максимальна, называется температурным оптимумом. Температурный оптимум ферментов термофильных микроорганизмов находится в области более высоких температур.
Влияние рН на скорость ферментативной реакции
График зависимости ферментативной активности от рН представлен на рис. 33.
Рис. 33. Влияние рН на скорость ферментативной реакции
График зависимости от рН имеет колоколообразную форму. Значение рН, при котором активность фермента максимальна, называется рН-оптимумом фермента. Значения рН-оптимума для различных ферментов колеблются в широких пределах.
Характер зависимости ферментативной реакции от рН определяется тем, что этот показатель оказывает влияние на:
a) ионизацию аминокислотных остатков, участвующих в катализе,
b) ионизацию субстрата,
c) конформацию фермента и его активного центра.
Ингибирование ферментов
Скорость ферментативной реакции может быть снижена действием ряда химических веществ, называемых ингибиторами . Некоторые ингибиторы являются для человека ядами, например, цианиды, другие – используются в качестве лекарственных препаратов.
Ингибиторы можно разделить на два основных типа: необратимые и обратимые . Необратимые ингибиторы (I) связываются с ферментом с образованием комплекса, диссоциация которого с восстановлением активности фермента невозможна:
Примером необратимого ингибитора является диизопропилфторфосфат (ДФФ). ДФФ ингибирует фермент ацетилхолинэстеразу, играющего важную роль в передаче нервного импульса. Этот ингибитор взаимодействует с серином активного центра фермента, блокируя тем самым активность последнего. Вследствие этого нарушается способность отростков нервных клеток нейронов проводить нервный импульс. ДФФ является одним из первых веществ нервно-паралитического действия. На его основе создан ряд относительно нетоксичных для человека и животных инсектицидов - веществ, ядовитых для насекомых.
Обратимые ингибиторы, в отличие от необратимых, при определенных условиях могут быть легко отделены от фермента. Активность последнего при этом восстанавливается:
Среди обратимых ингибиторов выделяют конкурентные и неконкурентные ингибиторы.
Конкурентный ингибитор, являясь структурным аналогом субстрата, взаимодействует с активным центром фермента и таким образом перекрывает доступ субстрата к ферменту. При этом ингибитор не подвергается химическим превращениям и связывается с ферментом обратимо. После диссоциации комплекса EI фермент может связаться либо с субстратом и преобразовать его, либо с ингибитором (рис. 34.). Поскольку и субстрат и ингибитор конкурируют за место в активном центре, такое ингибирование называется конкурентным.
Рис. 34. Механизм действия конкурентного ингибитора.
Конкурентные ингибиторы используются в медицине. Для борьбы с инфекционными болезнями ранее широко применялись сульфаниламидные препараты. Они близки по своей структуре к пара-аминобензойной кислоте (ПАБК), необходимому фактору роста многих патогенных бактерий. ПАБК является предшественником фолиевой кислоты, которая служит кофактором ряда ферментов. Сульфаниламидные препараты выступают в качестве конкурентного ингибитора ферментов синтеза фолиевой кислоты из ПАБК и тем самым подавляют рост и размножение патогенных бактерий.
Неконкурентные ингибиторы по структуре не сходны с субстратом и при образовании EI взаимодействуют не с активным центром, а с другим участком фермента. Взаимодействие ингибитора с ферментом приводит к изменению структуры последнего. Образование EI-комплекса является обратимым, поэтому после его распада фермент вновь способен атаковать субстрат (рис. 35).
Рис. 35. Механизм действия неконкурентного ингибитора
В качестве неконкурентного ингибитора может выступать цианид CN - . Он связывается с ионами металлов, входящими в состав простетических групп и подавляет активность этих ферментов. Отравления цианидами крайне опасны. Они могут привести к летальному исходу.
Аллостерические ферменты
Термин «аллостерический» происходит от греческих слов allo – другой, stereo – участок. Таким образом, аллостерические ферменты наряду с активным центром имеют другой центр, называемый аллостерический центр (рис. 36). С аллостерическим центром связываются вещества, способные изменять активность ферментов, эти вещества называют аллостерическими эффекторами . Эффекторы бывают положительными – активирующими фермент, и отрицательными – ингибирующими, т.е. снижающими активность фермента. Некоторые аллостерические ферменты могут подвергаться действию двух и более эффекторов.
Рис. 36. Структура аллостерического фермента.
Регуляция мультиферментных систем
Некоторые ферменты действуют согласованно, объединяясь в мультиферментные системы, в которых каждый фермент катализирует определенную стадию метаболитического пути:
В мультиферментной системе есть фермент, который определяет скорость всей последовательности реакций. Этот фермент, как правило, бывает аллостерическим и находится в начале матаболитического пути. Он способен, получая различные сигналы, как повышать, так и понижать скорость катализируемой реакции, тем самым регулируя скорость всего процесса.